Funkcjonalne powiązanie genetyczne między różnymi zaburzeniami rozwojowymi czesc 4

Na koniec zbadaliśmy możliwość wpływu seksu lub imprintingu w obrębie QTDT, używając tych dziewięciu haplotypów znaczników SNP. Wyniki
CNTNAP2 jako cel FOXP2
Rysunek 1. Rysunek 1. Identyfikacja CNTNAP2 jako bezpośredniego wiązania neuronowego przez człowieka FOXP2. W panelu A klon o wielkości 300 pz zidentyfikowano przez klonowanie z użyciem broni typu shotgun fragmentów genów zidentyfikowanych przez immunoprecypitację z użyciem chromosomu FOXP2 i umiejscowiono w intronie ludzkiego genu CNTNAP2 w 7q35. Półilościowe analizy PCR wykazały konsekwentne wzbogacanie tego regionu w wielu niezależnych eksperymentach w linii komórkowej podobnej do neuronu, poddanej immunoprecypitacji za pomocą N-końcowego przeciwciała FOXP2 (ścieżka 2), w porównaniu z próbką kontrolną bez przeciwciała (ścieżka 3) i wejściowych próbek DNA (ścieżka 1). Ścieżka 4 pokazuje próbkę kontrolną wody. Zidentyfikowano dwa miejsca wiążące konsensus FOXP2 (zaznaczono na czerwono). W panelu B testy zmiany ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) z użyciem ekstraktów jądrowych z transfekowanych komórek HEK293T oceniały zdolność białka FOXP2 do wiązania z miejscem wiązania konsensusu 5 (zaznaczone na czerwono). Wydajne wiązanie z sondą CNTNAP zaobserwowano, gdy FOXP2 był obecny, ale nie było, gdy użyto albo nietransfekowanych komórek albo komórek eksprymujących zmutowaną formę FOXP2 (R553H). Wiązanie z znakowaną sondą zostało skutecznie zmniejszone przez rywalizację z nieznakowaną sondą (CNTNAP). ale nie przez zmutowaną formę sondy (CNTNAP-M) lub nieistotne miejsce wiązania (NFK). Strzałka pokazuje pozycję przesunięcia spowodowaną wiązaniem FOXP2 z sondą CNTNAP.
Aby zidentyfikować potencjalne geny, które mogą być związane z typowym zaburzeniem określonego języka, wykorzystaliśmy metodę bezstronnej przeszukiwania do wyizolowania fragmentów genomowych powiązanych przez białko FOXP2 w chromatynie ludzkich komórek podobnych do neuronów. W ten sposób odkryliśmy fragment związany z FOXP2, który był szczególnie interesujący, ponieważ znajdował się w intronie CNTNAP2 (Figura 1A). Gen ten koduje CASPR2, członka nadrodziny neu- ksyny białek transbłonowych, znalezionej w węzłach Ranvier w mielinowych włóknach nerwowych. U myszy Caspr2 odgrywa ważną rolę w regulacji lokalizacji i konserwacji kanałów potasowych aktywowanych napięciem typu Shaker31 i jest zaangażowany w rozpoznawanie neuronów i adhezję komórek32. U ludzi sugerowano, że CASPR2 bierze udział w rozwoju kory mózgowej, prawdopodobnie pośredniczenie między interakcjami międzykomórkowymi podczas migracji neuroblastów i organizacji laminarnej
Użyto PCR do amplifikacji sekwencji obejmujących fragment CNTNAP2 związany z FOXP2 w niezależnych próbkach immunoprecypitacji chromosomowej FOXP2 i w próbkach kontrolnych, w których nie stosowano przeciwciał i obserwowano dowody wzbogacenia tylko wtedy, gdy do izolacji chromatyny użyto przeciwciał specyficznych dla FOXP2 ( Figura 1A). Startery amplifikujące regiony o 1000 bp lub więcej od związanego fragmentu nie wykazywały wzbogacenia immunoprecypitacją FOXP2 chromatyny. Uważa się, że FOXP2 wiąże chromatynę jako dimer, a nasze analizy in silico fragmentu wzbogaconego w immunoprecypitację chromatyny zidentyfikowały dwa sąsiednie miejsca, rozdzielone 48 zasadami, pasujące do znanej sekwencji konsensusowej dla wiązania FOXP2 (CAAATT). Analizy EMSA wskazały, że FOXP2 może wiązać oba miejsca (dane niepokazane)
[więcej w: cennik implantów, dentysta płock, naklejka na legitymację ]

Powiązane tematy z artykułem: cennik implantów dentysta płock naklejka na legitymację